è figlia d'arte, nata dall'attore Vittorio Mezzogiorno e dall'attrice Cecilia Sacchi.
Studia recitazione e lavora per due anni a Parigi, presso il laboratorio teatrale di Peter Brook. La sua carriera comincia nel 1995, quando debutta a teatro in Qui est là, un riadattamento dell'Amleto, ad opera dello stesso Peter Brook, in cui ha il ruolo di Ofelia.
Nel 1997 debutta nel cinema con il film di Sergio Rubini, Il viaggio della sposa, per il quale vince il Premio Flaiano, come migliore interprete femminile. Successivamente recita nel film Del perduto amore, di e con Michele Placido, e nel film tv Più leggero non basta, diretto da Elisabetta Lodoli; sul set conosce Stefano Accorsi, che diventa il suo compagno per un lungo periodo.
Nel 2000 è nel ricco cast internazionale della miniserie tv francese, Les Misérables. Sempre nel 2001, recita la parte di Giovanna nel film Tutta la conoscenza del mondo di Eros Puglielli, con Giorgio Albertazzi.
Il 2001 è l'anno della consacrazione con "L'ultimo bacio" di Gabriele Muccino con Stefano Accorsi. Il successo del film è clamoroso e lancia la Mezzogiorno nel firmamento delle star.
Il 2002 la vede impegnata con un ruolo importante e difficile, quello di Ilaria Alpi, la giovane giornalista del Tg3, morta in circostanze ancora non chiarite durante la guerra in Somalia. Il film, dal titolo Ilaria Alpi - Il più crudele dei giorni, diretto da Ferdinando Vicentini Orgnani, le frutta il Nastro d'Argento, per la miglior interpretazione femminile.
Seguono, nel 2003, il film tv Il segreto di Thomas e il film La finestra di fronte, di Ferzan Ozpetek, con Raul Bova e Massimo Girotti. In questo film recita la parte di Giovanna, una ragazza che, grazie al misterioso incontro con un anziano che non ha più ricordi, ritroverà la memoria dei propri sentimenti. Per La finestra di fronte riceve numerosissimi premi: il Ciak d'Oro, il David di Donatello, il Nastro d'Argento e, ancora una volta, il Premio Flaiano.
Nel 2004 è Lena nel film di Sergio Rubini, L'amore ritorna, dove recita insieme allo stesso Rubini, a Michele Placido, a Mariangela Melato, a Fabrizio Bentivoglio e a Margherita Buy. Nello stesso anno la vediamo come protagonista nella commedia di produzione italo-francese Il club delle promesse. Ritorna inoltre a recitare in teatro in 4.48 Psychosis, un pezzo di Sarah Kane, per la regia di Piero Maccarinelli.
Nel 2005 è Sabina in La bestia nel cuore di Cristina Comencini, in cui interpreta una giovane doppiatrice che attraversa il lato oscuro della sua vita, legato ad un episodio di abuso. Grazie a questa interpretazione vince la Coppa Volpi, per la miglior interpretazione femminile alla 62ª Mostra internazionale d'arte cinematografica di Venezia. Il film viene candidato al Premio Oscar (2006), come miglior film straniero.
Nel 2006 è la protagonista del film sci-fi AD Project, diretto da Eros Puglielli, ancora accanto a Giorgio Albertazzi. L'anno successivo è Fermina Daza in L'amore ai tempi del colera (Love in the time of Cholera), con l'attore spagnolo Javier Bardem come Florentino Ariza. Film girato a Cartagena de Indias, Colombia, basato sul libro L'amore ai tempi del colera (El amor en los tiempos del cólera), scritto da Gabriel Garcia Marquez.
Sempre nel 2007 è sul grande schermo con il film di Francesca Archibugi, Lezioni di volo e in quello d'esordio di Davide Marengo, Notturno bus, al fianco di Valerio Mastandrea.
Nel 2008 le viene assegnato il ruolo da protagonista in Vincere, film diretto da Marco Bellocchio, in cui interpreta Ida Dalser, presunta prima moglie di Benito Mussolini (non esiste alcun documento ufficiale) e madre di suo figlio Benito Albino. Il film è stato girato a Torino, Venezia e Trento e viene presentato, unico film italiano, al Festival di Cannes 2009.
Nel 2009 è anche protagonista, insieme a Riccardo Scamarcio, del film La prima linea, regia di Renato De Maria. Inoltre è co-produttrice e voce narrante del film-documentario Negli occhi, sulla vita e sulla carriera del padre, presentato in concorso nella sezione "Controcampo Italiano" della 66ª Mostra internazionale d'arte cinematografica di Venezia.
Nel 2010 partecipa insieme a Max Gazzè, Rocco Papaleo, Alessandro Gassman e Paolo Briguglia, al film Basilicata coast to coast interpretando il ruolo di una giornalista, figlia di un politico locale, che svolge un reportage sull'avventura dei quattro musicisti che da Maratea si recano a piedi sino a Scanzano Jonico per partecipare ad un festival musicale.
Nel gennaio 2011 negli Stati Uniti è stata premiata come migliore attrice protagonista per il ruolo di Ida Dalser in Vincere dal National Society of Film Critics Awards 2010 - l'associazione a stelle e strisce di critici cinematografici.
Proprio sul set di Vincere ha conosciuto il macchinista Alessio Fugolo, suo marito. Da lui ha avuto Leone e Zeno, i due gemellini nati il 26 agosto 2011.
Studia recitazione e lavora per due anni a Parigi, presso il laboratorio teatrale di Peter Brook. La sua carriera comincia nel 1995, quando debutta a teatro in Qui est là, un riadattamento dell'Amleto, ad opera dello stesso Peter Brook, in cui ha il ruolo di Ofelia.
Nel 1997 debutta nel cinema con il film di Sergio Rubini, Il viaggio della sposa, per il quale vince il Premio Flaiano, come migliore interprete femminile. Successivamente recita nel film Del perduto amore, di e con Michele Placido, e nel film tv Più leggero non basta, diretto da Elisabetta Lodoli; sul set conosce Stefano Accorsi, che diventa il suo compagno per un lungo periodo.
Nel 2000 è nel ricco cast internazionale della miniserie tv francese, Les Misérables. Sempre nel 2001, recita la parte di Giovanna nel film Tutta la conoscenza del mondo di Eros Puglielli, con Giorgio Albertazzi.
Il 2001 è l'anno della consacrazione con "L'ultimo bacio" di Gabriele Muccino con Stefano Accorsi. Il successo del film è clamoroso e lancia la Mezzogiorno nel firmamento delle star.
Il 2002 la vede impegnata con un ruolo importante e difficile, quello di Ilaria Alpi, la giovane giornalista del Tg3, morta in circostanze ancora non chiarite durante la guerra in Somalia. Il film, dal titolo Ilaria Alpi - Il più crudele dei giorni, diretto da Ferdinando Vicentini Orgnani, le frutta il Nastro d'Argento, per la miglior interpretazione femminile.
Seguono, nel 2003, il film tv Il segreto di Thomas e il film La finestra di fronte, di Ferzan Ozpetek, con Raul Bova e Massimo Girotti. In questo film recita la parte di Giovanna, una ragazza che, grazie al misterioso incontro con un anziano che non ha più ricordi, ritroverà la memoria dei propri sentimenti. Per La finestra di fronte riceve numerosissimi premi: il Ciak d'Oro, il David di Donatello, il Nastro d'Argento e, ancora una volta, il Premio Flaiano.
Nel 2004 è Lena nel film di Sergio Rubini, L'amore ritorna, dove recita insieme allo stesso Rubini, a Michele Placido, a Mariangela Melato, a Fabrizio Bentivoglio e a Margherita Buy. Nello stesso anno la vediamo come protagonista nella commedia di produzione italo-francese Il club delle promesse. Ritorna inoltre a recitare in teatro in 4.48 Psychosis, un pezzo di Sarah Kane, per la regia di Piero Maccarinelli.
Nel 2005 è Sabina in La bestia nel cuore di Cristina Comencini, in cui interpreta una giovane doppiatrice che attraversa il lato oscuro della sua vita, legato ad un episodio di abuso. Grazie a questa interpretazione vince la Coppa Volpi, per la miglior interpretazione femminile alla 62ª Mostra internazionale d'arte cinematografica di Venezia. Il film viene candidato al Premio Oscar (2006), come miglior film straniero.
Nel 2006 è la protagonista del film sci-fi AD Project, diretto da Eros Puglielli, ancora accanto a Giorgio Albertazzi. L'anno successivo è Fermina Daza in L'amore ai tempi del colera (Love in the time of Cholera), con l'attore spagnolo Javier Bardem come Florentino Ariza. Film girato a Cartagena de Indias, Colombia, basato sul libro L'amore ai tempi del colera (El amor en los tiempos del cólera), scritto da Gabriel Garcia Marquez.
Sempre nel 2007 è sul grande schermo con il film di Francesca Archibugi, Lezioni di volo e in quello d'esordio di Davide Marengo, Notturno bus, al fianco di Valerio Mastandrea.
Nel 2008 le viene assegnato il ruolo da protagonista in Vincere, film diretto da Marco Bellocchio, in cui interpreta Ida Dalser, presunta prima moglie di Benito Mussolini (non esiste alcun documento ufficiale) e madre di suo figlio Benito Albino. Il film è stato girato a Torino, Venezia e Trento e viene presentato, unico film italiano, al Festival di Cannes 2009.
Nel 2009 è anche protagonista, insieme a Riccardo Scamarcio, del film La prima linea, regia di Renato De Maria. Inoltre è co-produttrice e voce narrante del film-documentario Negli occhi, sulla vita e sulla carriera del padre, presentato in concorso nella sezione "Controcampo Italiano" della 66ª Mostra internazionale d'arte cinematografica di Venezia.
Nel 2010 partecipa insieme a Max Gazzè, Rocco Papaleo, Alessandro Gassman e Paolo Briguglia, al film Basilicata coast to coast interpretando il ruolo di una giornalista, figlia di un politico locale, che svolge un reportage sull'avventura dei quattro musicisti che da Maratea si recano a piedi sino a Scanzano Jonico per partecipare ad un festival musicale.
Nel gennaio 2011 negli Stati Uniti è stata premiata come migliore attrice protagonista per il ruolo di Ida Dalser in Vincere dal National Society of Film Critics Awards 2010 - l'associazione a stelle e strisce di critici cinematografici.
Proprio sul set di Vincere ha conosciuto il macchinista Alessio Fugolo, suo marito. Da lui ha avuto Leone e Zeno, i due gemellini nati il 26 agosto 2011.
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